МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ

УДК 577.125.8+612.1+616.127.005.8

М. К. Карагезян

Особенности влияния гипоксического синдрома при зеараленоновой
интоксикации на механизм формирования срывов резистентности
эритроцитов к перекисному гемолизу и корригирующее действие
сверхнизких доз физиологически активных соединений

(Представлено академиком А.А. Галояном 16/III 2004)

   Гипоксические состояния, в частности при микотоксиновых отравлениях, характеризуются понижением степени резистентности эритроцитов к перекисному гемолизу [1,2].
   В работе отражены основные положения, свидетельствующие об особенностях перестройки молекулярных механизмов, ответственных за формирование повышенного фона перекисеобразования в условиях экспериментального зеараленонового токсикоза. В основе сложного симптомокомплекса болезненных проявлений специально акцентируется патогенетическая роль ярко выраженного гипоксического синдрома (ГС), ставшего предметом наших настоящих исследований.
   Исследования проводили на 80 беспородных белых крысах-самцах с моделированным зеараленоном микотоксиновым токсикозом. Стабилизированную на оксалате кровь (1:9), забранную шприцем из angulus venosus (место слияния подключичной и верхней полой вен) в количестве 2 мл, переносили в толстостенные пробирки и центрифугировали при 3-4000 об/мин на протяжении 10 мин. Образовавшуюся надосадочную жидкость сливали, осадок промывали 2-3 раза охлажденным физиологическим раствором с рН 7.3-7.4, придерживаясь описанных выше условий центрифугирования. Заключительное центрифугирование производили при 5000 об/мин в течение 15-20 мин, уплотненный осадок эритроцитов использовали для определения степени их резистентности к перекисному гемолизу с применением цианметгемоглобинового метода [3], содержания малонового диальдегида (МДА) [4,5] и уровня эндогенного плазменного a-токоферола [6], определенного спектрофлюорометрически на флюорометре фирмы "Хитачи" (Япония). С использованием известных методов осуществляли изоляцию и очистку мембран эритроцитов (МЭ) [7], а также количественное определение в них белка [8].
   Цель настоящего исследования заключалась в выявлении и изучении особенностей изменения процесса перекисеобразования в эритроцитах и МЭ на фоне развитого гипоксического синдрома, а также возможных путей лимитирования интенсивности его течения применением: 1) парентеральных введений сверхнизких доз (10-12М) тиосульфата натрия (ТСН) и кальциевого преципитата дрожжевой низкомолекулярной двуспиральной РНК (Са2+-дс-РНК) в отдельности и 2) в виде комбинированной антиоксидантотерапии путем сочетанных введений использованных активных начал.
   Как известно, липидная пероксидация, являясь сложным сочетанием реакций, в определенных пределах интенсивности своего течения выступает в роли физиологически необходимого и обязательного компонента в регуляции жизнедеятельности клетки в целом. В то же время считается неоспоримым [9-15] ее участие в качестве мощного патогенетического фактора в случаях чрезмерной активации процесса перекисеобразования с выходом особо высоких концентраций токсических продуктов переокисления липидов, обусловливающих в известной степени молекулярные механизмы стартирования, развития и генерализации болезненных состояний различного профиля. Как результат формирующегося при этом ГС выступают поражения периферических органов, в том числе и поджелудочной железы.
   При ГС немаловажное значение придается физиологическому состоянию эритроцитов и их мембран как важнейших фиксаторов и транспортеров кислорода, а также носителей мощного катализатора процессов свободнорадикального окисления (СРО) липидов - гемоглобина [1].
   Как явствует из данных табл. 1, 2, на фоне зеараленоновой интоксикации отчетливо проявляется картина ярко выраженного активирования реакции СРО липидов как в эритроцитах, так и особенно в их мембранах. Интенсификация процессов перекисеобразования в эритроцитах при исследованной патологии является своеобразным объяснением природы основных элементов патогенетического комплекса изученной патологии, обусловленной, в частности, мембранотоксическим, а в далеко зашедших случаях и мембранолитическим действием липидных перекисей, характеризующихся гемолизом, миграцией креатинкиназы в периферическую кровь, расстройствами экзокринной функции панкреаса и многими другими нарушениями в деятельности органов и систем организма.

Таблица 1

Содержание малонового диальдегида в эритроцитах белых крыс (в ммкМ/мл
эритроцитарной массы) в контроле (I), при зеараленоновой интоксикации (II) и
после лечения (III) на фоне изолированного применения ТСН (А), Са2+-дс-РНК
(Б) и их сочетанного комбинированного действия (В)

Больные
    Объект исследования I II       % разницы от I III       % разницы от I
А 109.9±2.90 189.7±3.10* +73.0 149.8±3.10** +36.0
Эритроциты Б 111.0±2.10 199.3±3.70* +80.0 143.1±2.90** +30.0
В 111.9±2.70 193.9±3.65* +73.0 119.7±1.80*** +7.0
Примечание. А - n = 16; Б - n = 18; В - n = 20; эффекты антиоксидантов определялись на 20-25 дни болезни; *-P < 0.001,
**-P < 0.01, ***-P < 0.5 (по сравнению с контролем).

Таблица 2

Содержание малонового диальдегида в эритроцирной мембране белых крыс
(в мМ/мг белка) в контроле (I), при зеараленоновой интоксикации (II) и после
лечения (III) на фоне изолированного применения ТСН (А), Са2+-дс-РНК (Б)
и их сочетанного комбинированного действия (В)

Больные
    Объект исследования I II       % разницы от I III       % разницы от I
А а 4.6±0.412 9.9±0.89* +115.0 7.8±0.55* +69.0
б 2.6±0.371 6.9±0.71* +165.0 6.8±0.83* +162.0
Мембраны Б а 4.7±0.691 10.8±0.99* +130.0 5.7±0.721*** +21.0
эритроцитов б 2.4±0.711 6.0±0.71* +150.0 4.4±0.72** +83.0
В а 4.0±0.421 9.7±1.11* +142.0 4.8±0.81*** +20.0
б 2.2±0.892 6.5±0.69** +190.0 3.0±0.45*** +36.0
Примечание. А - n = 15; Б - n = 25; В - n = 28; а) и б) обозначают выход малонового диальдегида соответственно в
НАДФН- и аскорбат-зависимой системах; остальные обозначения те же, что и в табл. 1.

   Примечательно, что, согласно нашим наблюдениям, активное состояние процесса СРО липидов в эритроцитах и МЭ сопровождается постепенным вовлечением в общий ГС организма наиболее чувствительных периферических органов.
   На основании данных, отраженных в табл. 2, становится очевидным, что в МЭ интоксицированных животных интенсивность течения процессов СРО липидов оказывается несравненно более ускоренной, нежели в цельных эритроцитах и особенно в аскорбат-зависимой системе переокисления, что пока остается трудно объяснимым. Вместе с тем нарушения реакций перекисеобразования в МЭ поддаются коррекции с помощью примененных методов антиоксидантотерапии относительно быстрее и более демонстративно в ферментативной НАДФН-зависимой системе переокисления липидов. Этот факт мы склонны объяснить несравненно более высокой степенью чувствительности ферментных систем организма как к негативным воздействиям, так и к эффектам нормализующих факторов, принимающих участие, в частности, в процессах, регулирующих интенсивность течения реакций перекисеобразования в изученных нами биологических объектах.
   Как показали результаты проведенных исследований, колебания количественного содержания МДА в изученных объектах оказались далеко не однотипными. Так, например, как явствует из табл. 1 и 2, уровень МДА как в эритроцитах, так и в МЭ с изолированным применением использованных терапевтических средств колебался в пределах достаточно высоких показателей. Иная картина прослеживалась в динамике содержания МДА у животных, в отношении которых был использован предложенный нами вариант комбинированной антиоксидантотерапии. Инъекции одного только ТСН сопровождались заметным сокращением разрыва между уровнями МДА в эритроцитах интоксицированных животных. Несмотря на эти положительные сдвиги, отмеченное расхождение продолжало оставаться статистически достоверным (* * -P < 0.01), чувствительно превышая, таким образом, уровень перекисеобразования в контроле. Отмеченное выше сокращение разрыва между уровнями МДА у больных и здоровых белых крыс при введении ТСН становится еще более демонстративным, когда взамен ТСН давали Са2+-дс-РНК. Однако и в этом случае, хотя и проявлялось максимальное приближение количественного содержания МДА в эритроцитах животных с токсикозом к физиологическим уровням, расхождения оставались статистически достоверными. Наконец, результаты по изысканию наиболее результативных терапевтических мероприятий, направленных на достижение высокого лечебного эффекта с полным восстановлением характерного для нормально функционирующего организма уровня липидных перекисей в эритроцитах и МЭ, привели нас к идее одновременного применения указанных антиоксидантов. Как показали полученные данные, сочетанное использованиение ТСН и Са2+-дс-РНК приводит к почти полному восстановлению нормального уровня МДА в изученных биологических системах (P < 0.5). Идея об одновременном применении этих двух активных начал при зеараленоновой интоксикации возникла на основании данных [19,20] о важной синергической роли аскорбиновой кислоты в стабилизации и поддержании гидроксиформы a-токоферола как единственно активной разновидности этого витамина, наделенной антиоксидантными свойствами. Это в равной мере касается и примененных в настоящем исследовании сверхнизких доз ТСН и Са2+-дс-РНК как важнейших физиологически  активных  соединений  антиоксидантного  действия [21]. Действительно, как вытекает из результатов, приведенных в табл. 1, 2, именно сочетанная дача двух отмеченных соединений оказывается наиболее результативной в достижении эффекта лимитирования интенсивности течения перекисеобразовательного процесса в эритроцитах и МЭ при изучаемой патологии. По всей вероятности, предлагаемый нами метод комбинированной антиоксидантотерапии может оказаться весьма полезным и в снятии общего фона ГС, способствуя тем самым и повышению терапевтической эффективности использованных лечебных средств, а также достижению эффекта обратного развития нередко наблюдающихся дегенеративно-воспалительных поражений периферических органов, в частности поджелудочной железы [21-27].
   Полученные результаты свидетельствуют о важном диагностическо-прогностическом значении при зеараленоновых отравлениях такого информативного показателя, каковым является перекисная резистентность эритроцитов. Благодаря ему сообщается принципиально новая и вполне адекватная информация относительно природы молекулярных механизмов патогенеза изученного болезненного состояния, основывающихся, в частности, на интенсификации реакций перекисеобразования в эритроцитах и МЭ.
   Описанные расстройства в картине СРО липидов в ферментативной и неферментативной системах переокисления липидов, равно как и своеобразное усугубление ГС, развивающегося и генерализующегося в условиях изученной патологии, являются обязательными, но не специфическими факторами в сложном переплетении многочисленных патогенетических механизмов любого болезненного состояния.

     Институт молекулярной биологии НАН РА


Литература

     1. Погосян Н.Р.  Свободнорадикальное окисление эритроцитарных липидов у больных атеросклерозом коронарных сосудов. Канд. дис. Ереван. 1981. 112 с.
     2. Карагезян К.Г., Геворкян Д.М.  - Вопр. мед. химии. 1989. Т. 5. С. 27-30.
     3. Бенисович В.И., Идельсон Л.И.  - Вопр. мед. химии.1973. Т. 19. Вып. 6. С. 597-599.
     4. Владимиров Ю.А.  - Биохимия. 1966. Т. 31. N 5. С. 507-520.
     5. Владимиров Ю.А., Арчаков А.И.  Перекисное окисление липидов в биологических мембранах. М. Наука. 1972. 250 с.
     6. Duggan D.D.  - Arch. Biochem. Biophys. 1959. V. 84. P. 116-118.
     7. Limber G., Davis R.T., Bekerman S.  - Blood. 1970. V. 36. N 1. P. 111-118.
     8. Lowry D.H., Rosenrough N.I., Farr A.L., Rahdall R.S.  - J. Biol. Chem. 1951. V. 193. P. 265-269.
     9. Карагезян К.Г.  - Лаб. дело. 1969. N 1. С. 3-6.
     10. Карагезян К.Г., Вартанян Г.С., Паносян А.Г.  - Бюлл. экспер. биол. и мед. 1981. N 8. С. 35-37.
     11. Карагезян К.Г., Сафарян М.Д., Аматуни В.Г.  - Журн. экспер. и клин. мед. 1980. N 1. С. 61-68.
     12. Карагезян К.Г., Овсепян Л.М., Адонц К.Г. и др.  - Вопр. мед. химии. 1982. N 5. С. 58-59.
     13. Карагезян К.Г., Бадалян Г.О., Данилова Л.Л., Ордян В.В.  - Кровообращение. 1986. N 3. С. 24-24.
     14. Карагезян К.Г., Овакимян С.С., Геворкян Э.М. и др.  - Биоантиоксидант. Черноголовка. 1986. Т. 2. С. 24-27.
     15. Мхитарян В.Г., Геворкян Д.М.  - Биол. журн. Армении. 1980. Т. 33. N 6. С. 611-620.
     16. Ерин А.И.  - ДАН СССР. 1983. Т. 273. N 2. С. 489-493.
     17. Ерин А.И.  - Биохимия. 1983. Т. 48. N 11. С. 1855-1861.
     18. Jutley J.R., Kelleher J., Bremmen T.G., Denyer M.E., Mitchell C.J.  - Gut. 1988. V. 29. N 8. P. 1093-1097.
     19. Boyd E.J.S., Wormsley K.G.  - Int. J. Pancreatol. 1988. V. 3. N 2-3. P. 101-103.
     20. Neiderau C., Crass K.A., Silver G., Ferrell L.D., Grendell J.H.  - Gastroenterology. 1988. V. 95. N 6. P. 1648-1657.
     21. Едоян А.Р.  Специфика корригирующего действия сверхнизких доз факторов химической и физической природы при нарушениях метаболизма фосфолипидов у белых крыс с моделированным аллоксаном сахарным диабетом. Канд. дис. Ереван. 2004. 145 с.
     22. Kelemen D., Tцrцk B.  - Sebeszet. 1988. V. 41. N 2. P. 73-82.
     23. Inoue K., Hosotani R., Tatemoto K., Yajima H., Tobe T.  - Dis. Sci. 1988. V. 33. N 7. P. 828-832.
     24. Lesi C., Merli D’Eril G.V., Scotta M.S., Zoni L., Malaguti P.  - Int. J. Pancreatol. 1988. V. 3. N 2-3. P. 201-208.
     25. Robert J.H., Toledano A.E., Huang G., Toth L.S., Premus G., Papp M., Dreiling D.A.  - Mt Sinai J. Med. 1988. V. 55. N 5. P. 365-368.
     26. Schulz I., Ullrichm K., Frцmter E. e.a.  - Pbl. Arch. Ges. Physiol. 1965. V. 284. P. 360-363.
     27. Mangos J. e.a.  - Science. 1967. V. 158.